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浅析红豆杉种质冷冻保藏的方法

点击次数:    2019-12-13

       红豆杉种质冷冻保藏的方法都有哪些呢?下面欧洲红栎小苗给大家介绍一下。

  其一,材料及预处理。

  选用由茎尖幼叶诱导而来红豆杉愈伤组织TD2,继代培养于M62固体培养基上,培养温度为27℃,选用培养了 10-15天处于迅速生长状态的愈伤组织,分别转移到含有4%、6%和8%蔗糖的M62液体培养基中,分别培养6天、8天、10天和12天。

  其二,冷冻保护剂的选择。

  不同浓度(6%,8%,10%,12%,14%)的糖、糖醇或醇类物质,包括甘油、葡萄糖、山梨醉、甘露醇和聚乙二醇(PEG,分子量为1 000)与10%的二甲亚砜分别组合作为冷冻保护剂;DMSO+山梨醇+PEG多种成分的复合保护剂。

  将约100 的预培养后的材料置于冷冻保藏管内,加入冷冻保护剂,使之浸没愈伤组织,密封保藏管,在0℃下静置预处理30分钟。

  其三,冷冻、解冻的方法与过程。

  降温冷冻程序。将完成预处理后实验材料,分别采取快冻、慢冻和分步冷冻三种方法处理。

  (1)快冻是将预处理后的材料从0℃直接投入液氮中。

  (2)慢冻是将预处理后的材料先缓慢降温至-40 ℃,放置180分钟,然后投入液氮。

  (3)分步冷冻是将预处理后的材料降温至一20℃,停留30分钟,再缓慢降至一40℃,静置180分钟后投人液氮中保存。

  解冻和洗涤。材料经液氮保存后,取出并立即投入37℃水浴中解冻,待保藏管内的冰融化后,加入等体积的新鲜M62液体培养基(含3%的蔗糖)进行冲洗,然后吸去溶液,再用同样的培养液洗涤两次,每次停留10分钟。

  其四,冷冻、解冻的效果分析。

愈伤组织冷冻保存后的活力与预培养条件的关系。解冻后的愈伤组织用TTC(三苯基四氮唑氯化物)法测定其活力,具体方法如下。称取约100 mg洗涤后的愈伤组织,加入0.4%的TTC试剂和pH7.0的0.1mol·L的磷酸缓冲液各2.5ml,在黑暗下27℃左右放置13小时后弃去TTC液,用蒸馏水洗涤三次,再加入95%乙醇5ml,于60℃水浴30分钟,使细胞脱色完全,然后测定485nm下乙醇相的吸收值,吸收值越大,表明其细胞活力越强。

以上就是有关红豆杉的种质冷冻保藏的方法介绍,大家可以按照以上方法进行冷冻保藏,希望可以对大家有帮助。

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